Weefsel inbedden in kunststof, Technovit - De wereld onder de microscoop

Weefsel inbedden in kunststof, Technovit 7100

In de meeste histologische laboratoria is de paraffine-inbedding gebruikelijk. In bepaalde gevallen is het echter wenselijk om weefsel in kunststof te gieten. Zo kan met een kunststoftechniek een veel dunnere coupe gesneden worden en daardoor wordt een veel betere morfologie bereikt. Kunststoffen voor de histologie zijn er in drie vormen: GMA (glycol methacrylate) ,MMA (methyl methacrylate) en epoxy. De GMA, zoals Technovit, is een relatief zacht soort kunststof waarmee een snededikte tussen de 0,5-1µm bereikt kan worden. Deze coupes worden ook wel de semidunne coupes genoemd. GMA kan op een rotatiemicrotoom of een ultramicrotoom gesneden worden met stalen-, glazen- of diamanten messen. Van de stalen messen kunnen alleen de 'D' profiel messen gebruikt worden.

Het MMA kunststof, zoals Araldit en LR White, is harder en kan daarom nog dunner gesneden worden (50-70nm). De MMA kunststoffen worden uitsluitend met glazen- of diamanten messen gesneden op een ultramicrotoom. Een epoxy is b.v. Epon. Epon is hard en weefsel welke secundair gefixeerd is met osmium tetroxide kan probleemloos worden ingegoten. Deze coupes worden vervaardigd voor de electronemicroscopie.

Enkele voor- en nadelen van paraffine ten opzichte van kunststof staan in onderstaande tabel,

Paraffine	Kunststof
standaard in de histologie	wordt minder vaak toegepast
vrij snelle bewerkingstijd en eenvoudig in gebruik	vergt veel tijd en er moet heel nauwkeurig gewerkt worden
grote coupes mogelijk	uitsluitend kleine coupes mogelijk
vele kleuringen toepasbaar	weinig kleuringen te gebruiken
kan gesneden worden met goedkope wegwerpmesjes	messen zijn kostbaar
coupedikte beperkt tot 2-3µm	coupedikte bereikbaar tussen 50nm en 1µm
door de grote krimp meestal veel artefacten in coupe	weinig krimp, zeer goede morfologie
kan op een eenvoudig rotatie- of slede microtoom gesneden worden	GMA moet minimaal op een rotatiemicrotoom met retractie gesneden worden, MMA moet op een ultramicrotoom gesneden worden
harde weefsels zijn moeilijk te snijden	harde weefsels zijn goed te snijden

De firma Kulzer uit Duitsland heeft een GMA kunststof, Technovit 7100, in haar programma die voor een hobby-histoloog goed te gebruiken is. Een Broschure van Kulzer uit 2011 kan in 'Downloads' gedownload worden. Deze kunststof kan worden besteld bij b.v. Morphisto in Duitsland: https://www.morphisto.de/en/shop/detail/d/TECHNOVIT%C2%AE_7100//11823/

Onderstaand inbeddingsprotocol is gebaseerd op het inbedden van weefsel met Technovit 7100.

weefselblokjes mogen niet groter zijn dan ≈ 6 x 10mm en ≈ 5mm hoog; weefsel fixeren in formaldehyde 4%; gefixeerd weefsel spoelen in stromend leidingwater (24 uur); weefsel dehydrateren in ethanolreeks 50%, 70%, 85%, 95% en 100% (ik gebruik 12 of 24uurs stappen); infiltreren met een oplossing van ethanol 100% en Technovit 7100, 1:1, 24uur; 100ml Technovit mengen (15minuten) met 1gram harder I ; weefsel 48 uur in deze oplossing infiltreren (kamertemperatuur); verse infiltratie-oplossing nemen en het weefsel hier weer 48 uur in laten infiltreren; 15 delen infiltratie-oplossing mengen met 1 deel harder II (polymeer-oplossing); weefsel in gietmal leggen en volgieten met polymeer-oplossing; 1uur op kamertemperatuur laten polymeriseren; 2uur polymeriseren op 37º Celcius; kunststof blokhouder omgekeerd op gietmal plaatsen; 2 à 3 delen Technovit 3040 poeder mengen met 1 deel Technovit standaard (hier moet snel gewerkt worden omdat deze oplossing na 1 minuut reeds stroperig is en na 2 minuten hard is); na 15 minuten de blokken uit de gietmal verwijderen en er kan onmiddellijk gesneden worden.
	Het is aan te raden om verbruiksmaterialen te nemen die vervaardigd zijn van glas. Dit om vervuiling van het Technovit te minimaliseren.
	Gebruik van glazen pasteurpipetten om Technovit met harder II in de gietmal aan te brengen. Om de Technovit 3040 aan te brengen is het handig om een pipet te ontdoen van de smalle uitstroomopening en zo te gebruiken.
	15 delen infiltratie-Technovit met 1 deel harder II kan goed in een klein formaat reageerbuis worden aangemengd.
	Een verstelbare micropipet van b.v. 200-1000µl is handig om b.v. 15 delen infiltratieoplossing en 1 deel harder II af te meten.
	Technovit 7100, zakjes van 1gram harder I en 100ml harder II.
	De gietprocedure met Technovit 3040 in beeld.
	Technovit 3040 poeder en Technovit standaard.
	Vijf verschillende stukjes weefsel liggen in Technovit te polymeriseren.
	Het Technovit 3040 is in de omgekeerde blokhouders gegoten. Het gepolymeriseerde technovit met weefsel wordt hiermee stijf verbonden met de blokhouders.
	Na ongeveer 15 minuten kunnen de blokken uit de gietmal gewrikt worden. Ik noem wrikken omdat de blokken redelijk vast in de mal kunnen zitten. Doordat de gietvormen licht taps verlopen wordt het uitnemen vereenvoudigd.