Microscopen - De wereld onder de microscoop

1  Soorten microscopen;

2  Onderdelen van een lichtmicroscoop;

3  Oplossend vermogen;

4  Instellen van de microscoop volgens Köhler;

5  Microscoop aanschaffen.

1     Soorten microscopen [1]  

Microscopen kunnen verdeeld worden in: lichtmicroscopen en elektonenmicroscopen. Er zijn diverse soorten lichtmicroscopen die allen gebruik maken van licht maar dit licht op diverse manieren gebruiken om een preparaat te bestuderen. Enkele voorbeelden zijn:

- Doorvallichtmicroscopie, (wordt verreweg het meest toegepast en zal hieronder nader worden behandeld);

- Fasecontrastmicroscopie, ongekleurde preparaten hebben doorgaans geen contrast en geven in een doorvallichtmicroscoop geen bruikbaar beeld. De fasecontrast-LM is een vinding van Zernike (Nobelprijs 1953) en berust op het bewerken van kleine faseveranderingen die ontstaan door kleine brekingsverschillen in het preparaat, zodat deze zich voordoen als amplitudeveranderingen (licht/donker). Fasecontrast wordt toegepast op ongekleurde preparaten, zoals vers geïsoleerde of gekweekte levende cellen, of vriescoupes van ongefixeerd en ongekleurd weefsel. Gekleurde preparaten laten zich door fasecontrast niet goed afbeelden.

- Polarisatiemicroscopie, weefselcomponenten met een periodieke of repetitieve rangschikking van atomen, moleculen of supramoleculaire eenheden, hebben het vermogen om gepolariseerd licht te draaien, zodat uitdoving van het licht tussen twee gekruiste polarisatiefilters niet meer optreedt. Het eerste polarisatiefilter wordt onder de condensor aangebracht (polarisator) en het tweede tussen objectief en oculair (analysator).

- Fluorescentiemicroscopie, fluorescerende stoffen zetten licht van een korte golflengte, bijvoorbeeld blauw (excitatie), om in licht van een langere golflengte, bijvoorbeeld groen of rood (emissie). De lichtbundel passeert in een fluorescentie-LM eerst het exictatiefilter, dat het excitatielicht beperkt tot een bepaalde golflengte, terwijl het emissielicht, dat door het preparaat wordt uitgezonden, geleid wordt door een sperfilter, dat de rest van het excitatielicht uit de bundel verwijdert. Fluorescerende delen van het preparaat lichten op tegen een donkere achtergrond, zodat een zwak signaal of een structuur kleiner dan 0,25µm vaak nog zichtbaar wordt. Fluorescentiemicroscopie wordt veel toegepast met opvallende verlichting (epi-fluorescentie), waarbij de excitatie- en de emissiebundel door een halfdoorlaatbare spiegel van elkaar gescheiden worden.

- Confocale laser scanning microscoop

- Transmissie elektronenmicroscoop (TEM)

- Scanning elektronenmicroscoop (SEM)

De meeste preparaten worden in een lichtmicroscoop (LM) bekeken met doorvallend wit licht, daarom ook wel helderveld-LM (bright field) genoemd. Een LM (hieronder de Orthoplan van de firma Leitz) bestaat uit optische en fijnmechanische onderdelen. De optiek bestaat uit drie lenssystemen: de condensor, het objectief en de oculairen. De condensor bundelt het doorvallende licht op het preparaat. Deze belichting bepaalt, samen met het objectief, de lichtsterkte, het oplossend vermogen en de kwaliteit van het beeld [1].

1    Fototubus;

2    Statief;

3    Lamphuis;

4    Scherpstelknoppen, fijn en grof;

5    Nonius van de kruistafel;

6    Stelschroeven voor X- en Y-as verstelling kruistafel;

7    Verstelwiel van het veld diafragma;

8    Lichtopening;

9    Objecttafel;

10  Verstelhendel condensor diafragma;

11  Objectief;

12  Objectief revolver;

13  Stelschroef om oculairen op oogafstand af te stellen;

14  Traploos regelbare lampvoeding;

15  Oculairen.

Onder de objecttafel zit de condensor gemonteerd.

1   Hoogteverstelling condensor;

2   Afstelschroeven condensor (juiste afstelling is beschreven en vernoemd naar Köhler);

3   Verstelhendel condensor diafragma;

4   Condensorhuis.

Illustratie van een Leitz Orthoplan met het verloop van de lichtbundel (geel) en de belangrijkste onderdelen. Een lichtbron produceert wit licht, dat via een spiegel in de condensor, samengesteld uit enkele lenzen, wordt geleid. Het licht wordt door de condensor gebundeld op het preparaat. Het objectief kijkt met een korte, soms zeer korte, werkafstand naar het preparaat en vormt een vergroot beeld, dat door een oculair wordt navergroot en op de retina wordt geprojecteerd. Het prisma dient om de lichtweg te buigen, zodat een comfortabele zitpositie wordt verkregen voor de waarnemer [1].

Het oplossend vermogen van een microscoop (de resolutie) wordt gedefinieerd als de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven. Het oplossend vermogen is vooral afhankelijk van het objectief, in mindere mate van de condensor, terwijl het oculair niet veel bijdraagt. De beeldkwaliteit wordt bepaald door de kleurweergave, de transparantie, het contrast en de resolutie van de lenzen, terwijl eigenschappen van het preparaat ook belangrijk zijn. Een goede beeldinformatie wordt verkregen wanneer vergroting en resolutie in evenwicht zijn. Wanneer hogere vergroting niet gepaard gaat met een hoger oplossend vermogen, resulteert dat in een zinloze vergroting. Een zeer belangrijke specificatie van het objectief is de numerieke apertuur (NA). Een hogere waarde van de NA geeft een hoger oplossend vermogen maar ook een kortere werkafstand tot het preparaat[1]. Goede objectieven hebben een hoge NA en zijn inherent duur. Op de pagina Objectieven worden verschillende Leitz objectieven uitvoerig beschreven.

Uit theorie en praktijk is door August Köhler (1866-1948) een instelling geformuleerd waarmee het beste beeld uit een microscoop gehaald kan worden: de Köhlerbelichting. Deze optimale instelling geldt niet alleen voor bovengenoemde microscoop, maar in feite voor elke microscoop. Op de Duitse website van de Georg-August-Universität in Göttingen staat een goede animatie die afstelling volgens Köhler laat zien. Klik op de afbeelding om de video op youtube te starten (https://www.youtube.com/watch?v=lG32k2sLUjg) of klik op de afbeelding.

De instelling voor Köhlerbelichting is hieronder stap voor stap (a t/m k) uitgelegd aan de hand van de onderdelen van een Leitz Orthoplan:

a. Ga comfortabel, rechte rug achter de microscoop zitten;

b. Draai de lichtregeling (afb1, 14) op tot een rustig licht niveau. Draai het velddiafragma (afb1, 12) open;

c. Draai nu de condensor met de condensor-schroef (afb1, 11) zoveel mogelijk omhoog, maar laat hem niet tegen het preparaat komen;

d. Draai het condensor-diafragma (afb1, 10) geheel open;

e. Leg het preparaat op de objecttafel (afb1, 9) en stel het object bij een kleine vergroting (objectief 10x) scherp, eerst met de grove- , daarna met de fijn-instelling (afb1, 17).

f. Stel de stand tussen de oculairen (afb1, 4) optimaal in voor de afstand tussen de ogen. Gebruik hiervoor knop (afb1, 5).

g. Draai het velddiafragma (afb1, 12) dicht en regel de hoogte van de condensor met knop (afb1, 11) zodanig dat je al kijkend de gekartelde rand van het velddiafragma (afb1, 12) scherp ziet verschijnen.

h. Centreer de projectie van het velddiafragma met de condensor-centreerschroeven (afb2, 2)

i. Open het velddiafragma (afb1, 12) zodanig dat die aan de rand van het gezichtsveld nog net te onderscheiden is.

j. Sluit het condensor-diafragma (afb1, 10 en afb2, 3) tot de bij het objectief passende stand. Bij lage vergrotingen zal de optimale stand iets dichter zijn dan bij hoge vergrotingen. De microscoop is nu optimaal ingesteld voor een 10x objectief

k. Om hogere vergrotingen (objectief 40x of 100x) te gebruiken dient de procedure vanaf stap d tot stap j herhaald te worden, behalve stap f. (Noot: zet bij het 100x objectief de condensor altijd in de hoogste stand; de projectie van het velddiafragma is namelijk niet goed zichtbaar).

Alle moeite die gedaan wordt om een goed preparaat te verkrijgen zijn zinloos wanneer er geen goede microscoop aanwezig is om waar te nemen.

Op de vraag wat dan een goede microscoop is kan niet simpel een antwoord gegeven worden maar wel altijd geldt: "een goede microscoop is niet goedkoop".

Hieronder zijn enkele afwegingen genoemd die kunnen helpen bij de keuze van een microscoop.

Met een monoculair wordt met één oog door de microscoop gekeken. Dat wordt na een half uurtje zeer vermoeiend en van rustig kijken is dan geen sprake meer. De binoculair kijkt veel aangenamer en doordat er rustiger kan worden gekeken zijn meer details te zien. Bij een trinoculair is er een extra tubes aangebracht om later een foto- of videocamera aan te kunnen sluiten. Meestal ontstaat de wens om waargenomen beelden te kunnen fotograferen.

Niet noodzakelijk edoch bijna onmisbaar. Is er geen kruistafel dan moet met de hand het preparaat verschoven worden om 'door' het preparaat te kunnen kijken. Met name bij hogere vergrotingen en olieimmersieobjectieven is dit bijna niet te doen.

De betere microscopen hebben het allemaal. Het is een speciale lens die het licht van een lichtbron, die ongeveer in het brandpunt van de lens wordt geplaatst, zo bundelt dat een min of meer evenwijdige, gelijkmatig verdeelde bundel licht wordt verkregen. In het condensorgedeelte zit ook een diafragma om de hoeveelheid licht te kunnen regelen en meestal een of meer filterhouders om met gekleurd licht of polarisatiefilters te kunnen werken.

Een goede microscoop is solide uitgevoerd. De voet en statief zijn stevig en daarom ook zwaar.

Dit diafragma is voor een juiste instelling volgens 'Köhler' noodzakelijk.

Bijna alle oudere microscopen werken met een regelbare halogeenverlichting. Een goed regelbare halogeen verlichting voldoet  prima. LED verlichting heeft de laatste jaren z'n intrede gedaan en is aan een opmars begonnen. Tot ongeveer 2011 waren er alleen blauw/witte licht LED's beschikbaar, nu is bijna het hele traject van warm wit tot cool white leverbaar. Doordat er er meer korte golflengtes ter beschikking zijn dan vroeger, resulteert dit in een duidelijk betere detaillering van het preparaat dan voorheen. Verder heeft de LED enkele andere voordelen ten opzichte van halogeen, met name het lage wattage, en de geringe warmte emissie.. preparaten warmen niet op, en drogen niet uit, beestjes blijven rustiger liggen etc. Ook de microscoop zelf wordt niet meer warm, zelfs de warmte turbulentie in de lichtbaan is zoveel kleiner, dat het gebruik van een LED herkenbaar is bij het onderhoud, minder stof en aanslag. Nadelen zijn er natuurlijk ook. Het beeld van een LED is witter dan halogeen en vergt enige gewenning. Een LED heeft natuurlijk ook nadelen, die een uitdaging voor de ontwerper vormen, en komen vooral ter sprake bij de hogere vermogens. Een LED welke een 100 watt lamp zou vervangen kan extreem heet worden, en zichzelf onmiddelijk defekt maken, dit vraagt dus om een ruim berekende koeling (meestal een blok aluminium met vinnen). Hoewel de LED zelf heet kan worden, is de warmte emissie in het licht nihil. Ook de regeling moet van een hoogstaand kaliber zijn, vanwege het elektrische karaktertrekje van de LED dat deze eigenlijk alleen op stroom geregeld kan worden (halogeen regelt op spanning). Een en ander resulteert in een wat complexer geheel en is daarom duurder dan halogeen. Een test uitvoeren bij de vakhandel is aan te bevelen.

Een goed objectief is duur, een heel goed objectief is helaas heel duur!  Een merkloos objectief gemaakt in het verre Oosten hoeft niet persé slecht te zijn maar met een objectief van een gerenommeerd merk met perfecte glassoorten, op alle mogelijke velden gecorrigeerd en met een hoge numerieke apertuur is het zichtveld eenvoudig fantastisch. Voor de doorvallichtmicroscopie bestaan er drie soorten objectieven: achromatische, fluotars en apochromaten. Daarnaast kunnen objectieven gecorrigeerd zijn voor planiteit (scherp tot aan zichtbare veld). Op de objectievenpagina is veel nuttige informatie te vinden over verschillende Leitz objectieven.

Er bestaan verschillende gerenommeerde merken: Zeiss, Leica, Leitz, Olympus, Lomo, Hund en Nikon (Leitz microscopen zijn niet meer nieuw te verkrijgen. Leitz is opgegaan in Leica). Veel andere merken zoals 'Novex' zijn afkomstig uit China. Bij dit soort microscopen zijn geen of weinig accessoires te verkrijgen. De gerenommeerde merken zijn altijd duur, de Chinese import vaak veel goedkoper. De microscopie-hobby kan beginnen met een goedkope Chinese import maar later zal blijken dat een gerenommeerd merk toch meer wenselijk is.

Een nieuwe microscoop met hoogwaardige objectieven van een gerenommeerd merk is erg duur (€10.000 - €50.000).

Op de tweedehands markt zijn nog veel goede microscopen te verkrijgen. Op de Linkpagina staan enkele handelaren genoemd. Op veiling websites zoals 'ebay' zijn soms heel goede microscopen te koop.

De verschillen tussen dure onderzoeksmicroscopen en goedkope studentenmicroscopen zitten in de extra's en in de kwaliteit van de aanwezige componenten. Een kruistafel en ingebouwde verlichting maken een microscoop duurder. Solide uitvoering, goede optiek met objectieven die gecorrigeerd zijn voor allerlei soorten optische fouten (chromatische en sferische aberratie, vlakke beeldvelden), en ook de grootte van het te bekijken veld (hoeveel beeld zie je bij die 800× vergroting) maken een microscoop van topkwaliteit een zeer duur instrument. Het is beter een oude goede dan een goedkope nieuwe microscoop aan te schaffen. Speelgoedmicroscopen van enige tientallen euro's zijn vrijwel zonder uitzondering zeer slecht: het is beter voor dit geld een goede inslagloep met 2 of 3 elementen te kopen van 10-20× vergroting.

Bronvermelding:

[1] Junqueira L.C. en Carneiro J. (2004, tiende druk), Functionele histologie, Maarssen. Uitgeverij Elsevier. Hoofdstuk 1, 'Waarnemingsmethoden' blz 16 t/m 22.