Botvorming in diverse histologische kleuringen - De wereld onder de microscoop

Ga naar de inhoud

Hoofdmenu

Botvorming in diverse histologische kleuringen

Preparaten > Organen en cellen 2

Download deze pagina als .pdf , klik hier

Bronvermelding:
1  Theorie: Junqueira L.C. en Carneiro J. (2004,  tiende druk), Functionele histologie, Maarssen. Uitgeverij Elsevier.
   Hoofdstuk 8, pag. 161-170, ' Botweefsel', ISBN: 978-9035228627.
2  Wikipedia, de vrije encyclopedie,  http://nl.wikipedia.org/wiki/Hoofdpagina

Doel,

Botvorming of ossificatie² zichtbaar maken door middel van verschillende histologische kleuringen.

Inleiding¹

Bot kan op twee manieren ontstaan:
1. Endesmaal, hierbij wordt botweefsel direct vanuit het bindweefsel gevormd; de botafetting gebeurt hierbij in de vorm van een band (desmos).
2. Enchondraal, hierbij wordt botweefsel indirect gevormd doordat kraakbeen
² (chondros) vervangen wordt door bot.

In beide gevallen wordt eerst primair (gevlochten of plexiform) bot gevormd, dat spoedig vervangen wordt door secundair (lamellair) bot, dat macroscopisch een compact of spongieus uiterlijk kan hebben. Gedurende de botgroei komen er voortdurend gebieden van primair bot, botafbraak en secundair bot naast elkaar voor. Dit samengaan van afbraak en aanmaak (remodellering) gaat ook in het volwassen lichaam steeds door, zij het in een veel lager tempo.

Bot is samengesteld uit cellen en intercellulair materiaal dat verkalkt is, de bot- of beenmatrix. Drie typen cellen zijn te onderscheiden:
1. Osteoblasten (botvormende cellen), die de organische componenten van de botmatrix produceren. Osteoblasten ontstaan uit osteoprogenitorcellen, die voorkomen in endost² en periost². Osteblasten synthetiseren² de organische bestanddelen van de botmatrix en produceren dus collageen type I, proteoglycanen² en glycoproteïnen². Osteoblasten liggen in aaneengesloten rijen, de osteoblastenzoom, tegen het oppervlak van het bot aan;
2. Osteocyten (volwassen botcellen) die door rijping van osteoblasten ontstaan, liggen in holten (lacunae) van de botmatrix. Vanuit deze holten lopen in verschillende richtingen canaliculi door het bot, waarin zich de uitlopers van osteocyten bevinden. Zij maken contact met elkaar door middel van gap junctions², waardoor ionen en kleine moleculen uitgewisseld kunnen worden;
3. Osteoclasten (botafbrekende cellen); dit zijn grote multinucleaire (tot vijftig kernen) cellen die bot kunnen afbreken. Osteoclasten zijn vrij beweeglijke cellen en liggen als langgerekte cellen tegen de botrand, soms in een uitholling die ontstaan doordat zij matrix wegvreten: de lacune van Howship.

Materialen en methoden

Om de aankleuring van botvormend weefsel en de verschillen in kleuringen goed te kunnen waarnemen is ervoor gekozen om coupes te snijden van gelijksoortig weefsel welke op gelijke wijze gefixeerd is. Voor dit doel zijn vijf dagen oude muizen gefixeerd in Bouinse vloeistof. Om de fixatievloeistof makkelijker in het weefsel te laten binnendringen zijn de extremiteiten verwijderd en kleine incisies in de huid gemaakt. Weefsel heeft ongeveer twee maanden in Bouin gelegen waarna de dehydratie is begonnen in ethanol 70%. Het gebruikelijke uitspoelen van het fixatief in water heeft niet plaatsgevonden om te voorkomen dat weefsel teveel gaat zwellen. Verdere ethanolstappen waren 85%, 95% en 100% met een duur van 48 uur per stap. Via xyleen is daarna de overstap naar paraplast gemaakt. Om zeker te zijn dat alle xyleen vervangen werd door paraplast zijn drie vloeibare paraplastbaden gebruikt.
Weefsel is daarna gesneden op een A&O 820 rotatiemicrotoom met Leica 818 hoogprofiel microtoommessen. Na droging werd de paraffine via 2 xyleenbaden verwijderd en de coupes gehydrateerd in een ethanolreeks van 100%, 95%, 85%, 70% en 50%. Kleuringen welke zijn uitgevoerd zijn:
- Haematoxyline/Eosine;
- PTAH (Fosforwolfraamhaematoxyline);
- Van Gieson;
- Volgens Mallory uit 1900;
- AZAN volgens Heidenhain;
- Volgens Masson-Goldner.
Kleurprotocollen worden hierna genoemd. Na droging van de hars werden opnamen van de coupes gemaakt met een Moticam 2300 digitale microscoopcamera gemonteerd op een Leitz Orthplan microscoop.

Kleurprotocollen van de toegepaste kleuringen

Haematoxyline/eosine

Paraffinecoupes via xylol en dalende alcoholreeks in water brengen

stappen van 4 min

Kernkleuring met Haematoxyline (b.v. volgens Ehrlich, Gill enz)

4-5 min

Afspoelen AD (kort afspoelen is voldoende)

 

Blauwen in leidingwater

10 min

Spoelen AD

 

Eosine 1% (kort voor kleuren verdunnen 1:4 + enkele druppels ijsazijn 2%)

8 min

Spoelen AD

 

Ethanol 70% (totdat coupe op juiste kleur is)

≈ 30-60 sec

Ethanol 96%

2 min

Isopropanol 100% 2x

4 min

Xylol 1

4 min

Xylol 2

4 min

Insluiten in b.v. Depex

 
 

PTAH (Fosforwolfraamhaematoxyline)

Paraffinecoupes via xylol en dalende alcoholreeks in water brengen

stappen van 4 min

Oxideren in kaliumpermanganaat 0,25%

10 min

Spoelen AD

 

Oxaalzuur 5% (mangaandioxide verwijderen)

10 min

Spoelen AD

 

Fosforwolfraamhaematoxyline

16 uur

Ethanol 96% (dus niet eerst met AD spoelen)

≈ 1 min

Ethanol 96 %

1 min

Isopropanol 100% 2x

4 min

Xylol 1

4 min

Xylol 2

4 min

Insluiten in b.v. Depex

 

Fosforwolfraamhaematoxyline:
- 1g  haematoxyline  oplossen onder verwarmen in 50ml AD;
- 20g fosforwolfraamzuur oplossen in 50ml AD;
- Beide oplossingen mengen en enkele weken laten rijpen (eventueel kunstmatig rijpen door toevoeging van 0,177g kaliumpermanganaat).

 

Van Gieson (gemodificeerd)

Paraffinecoupes via xylol en dalende alcoholreeks in water brengen

stappen van 4 min

Kernkleuring met IJzerhaematoxyline (b.v. Weigert)

4 min

Spoelen AD

 

Blauwen in leidingwater

10 min

Spoelen AD

 

Kleuroplossing volgens van Gieson aanbrengen

7 min

Spoelen AD

 

Ethanol 96% (meerdere malen spoelen met schone ethanol, zie *)

≈ 1 min

Isopropanol 100% 2x

4 min

Xylol 1

4 min

Xylol 2

4 min

Insluiten in b.v. Depex

 

Gemodificeerde 'van Gieson' kleuroplossing:
- 60ml verzadigde waterige picrinezuur-oplossing (1,5g picrinezur overgieten met 500ml heet water en goed schudden. Oplossing is ongeveer 1,2%);
- 5ml waterige thiazine-rood oplossing van 1% toevoegen en mengen.

De originele 'van Gieson' oplossing is vervaardigd met zure fuchsine maar deze is onstabiel met basen en zuren waardoor de kleuring snel uitbleekt. Thiazine rood is beter bestendig tegen basen en zuren.
*Het spoelen in meerdere stappen met ethanol 96% heeft dan ook als doel om alle picrinezuur te verwijderen.
In principe kan ook met andere haematoxyline worden gekleurd echter is ijzerhaematoxyline beter bestand tegen het zure milieu van de 'van Gieson' kleuroplossing.

 

Volgens Mallory uit 1900

Paraffinecoupes via xylol en dalende alcoholreeks in water brengen

stappen van 4 min

Kernkleuring met Fuchsine (zuur) 0,1%

6 min

Spoelen AD

 

Fixeren in Fosformolybdeenzuur 2%

7 min

Spoelen AD

 

Kleuroplossing volgens Mallory

7 min

Spoelen AD

 

Differentiëren in Ethanol 96%

≈ 10-30 sec

Isopropanol 100% 2x

4 min

Xylol 1

4 min

Xylol 2

4 min

Insluiten in b.v. Depex

 

Kleurstof volgens Mallory:
- 0.5g Anilineblauw;
- 2g Orange G;
- 2g Oxaalzuur;
- In 100ml Aqua dest. koken en na afkoelen filtreren.

Deze variant uit 1900 gebruikt oxaalzuur. In 1936 werd de kleurstof bereid met fosforwolfraamzuur. Dat recept behoeft niet gekookt te worden maar slechts verwarmd.

 

AZAN volgens Heidenhain

Paraffinecoupes via xylol en dalende alcoholreeks in water brengen

stappen van 4 min

Kernkleuring met azokarmijn*

90 min

Spoelen met aniline ethanol*

3 min

IJsazijn ethanol*

1 min

Fixeren in fosformolybdeenzuur 5%*

90 min

Spoelen AD

 

Anilineblauw-Orange G-IJsazijn*

120 min

Spoelen AD

 

Differentiëren in ethanol 96%

≈ 60 sec

Isopropanol 100% 2x

4 min

Xylol 1

4 min

Xylol 2

4 min

Insluiten in b.v. Depex

 

Azokarmijn:
- 0,1g  azokarmijn-G kort koken in 100ml AD;
- Laten koelen en filtreren;
- 1ml ijsazijn (100%) toevoegen;
Bij gebruik van azokarmijn-B moet 0,25 tot 1g gebruikt worden. Ook hier 1ml ijsazijn toevoegen.

Aniline ethanol:
- 100ml ethanol (96%);
- 0,1ml aniline toevoegen.

IJsazijn ethanol:
- 100ml ethanol (96%);
- 1ml ijsazijn (100%) toevoegen.

Fosformolybdeenzuur:
- 5g Fosformolybdeenzuur oplossen in 100ml AD.

Anilineblauw-Orange G-IJsazijn:
- 0,5g aniline blauw + 2g orange G oplossen in 100ml AD;
- 8ml ijsazijn (100%) toevoegen;
- Kort koken en na afkoelen filtreren.

 

Volgens Masson-Goldner

Paraffinecoupes via xylol en dalende alcoholreeks in water brengen

stappen van 4 min

Kernkleuring met ijzerhaematoxyline (Weigert)

3 min (niet overkleuren)

Spoelen AD

 

Blauwen in leidingwater

10 min

Spoelen AD

 

Azophloxine-ijsazijn*

5 min

Spoelen in ijsazijn 1%

 

Fosformolybdeenzuur-orange G*

3 min

Spoelen in ijsazijn 1%

 

Lichtgroen SF-ijsazijn*

8 min

Spoelen in ijsazijn 1%

5 min

Differentiëren in Ethanol 96% (Lichtgroen spoelt snel af)

≈ 5 sec

Isopropanol 100% 2x (stopt onmiddellijk het differentiëren)

4 min

Xylol 1

4 min

Xylol 2

4 min

Insluiten in b.v. Depex

 

Azophloxine-ijsazijn:
- 0,5g azophloxine oplossen in 100ml AD;
- 0,2ml ijsazijn toevoegen.

Fosformolybdeenzuur-orange G:
- 3g fosformolybdeenzuur + 2g orange G oplossen in 100ml AD.
In plaats van fosformolybdeenzuur kan ook fosforwolfraamzuur gebruikt worden.

Lichtgroen SF-ijsazijn:
- 0,2g lichtgroen SF oplossen in 100ml AD;
- 0,2ml ijsazijn (100%) toevoegen.

 

Resultaten

 
Terug naar de inhoud | Terug naar het hoofdmenu